সেল ক্লাইম্বিং স্লাইডে ইমিউনোফ্লোরোসেন্সের ডাবল-লেবেল পরীক্ষার অপারেশন প্রক্রিয়া

1. কালচার প্লেটে, পিবিএস দিয়ে তিনবার আরোহণ করা স্লাইডগুলি প্রতিবার 3 মিনিটের জন্য ভিজিয়ে রাখুন।

2. স্লাইডগুলিকে 4 শতাংশ প্যারাফর্মালডিহাইড দিয়ে 15 মিনিটের জন্য ঠিক করুন, এবং প্রতিবার 3 বার, 3 মিনিটের জন্য পিবিএস-এ স্লাইডগুলি ভিজিয়ে রাখুন৷

3. ঘরের তাপমাত্রায় 20 মিনিটের জন্য 0.5 শতাংশ Triton X-100 (PBS-এ প্রস্তুত) দিয়ে পারমিবিলাইজ করুন (কোষের ঝিল্লিতে প্রকাশিত অ্যান্টিজেনের জন্য, এই ধাপটি বাদ দেওয়া হয়েছে)।

4. সিরাম ব্লকিং: প্রতিবার 3 মিনিটের জন্য 3 বার পিবিএস-এ স্লাইডগুলি ডুবিয়ে রাখুন, শোষক কাগজ দিয়ে পিবিএস শুকিয়ে নিন, স্লাইডে সাধারণ ছাগলের সিরাম যোগ করুন (যদি সেকেন্ডারি অ্যান্টিবডি উত্সটি ছাগল হয়) এবং ঘরের তাপমাত্রায় ব্লক করুন 30 মিনিট.

5. প্রাথমিক অ্যান্টিবডি যোগ করুন: শোষক কাগজ দিয়ে ব্লকিং দ্রবণ শোষণ করুন, ধুয়ে ফেলবেন না, প্রতিটি স্লাইডে পর্যাপ্ত পরিমাণে মিশ্রিত প্রাথমিক অ্যান্টিবডি যোগ করুন এবং এটি একটি ভেজা বাক্সে রাখুন, রাতারাতি 4 ডিগ্রিতে সেঁকুন।

6. ফ্লুরোসেন্ট সেকেন্ডারি অ্যান্টিবডি যোগ করুন: স্লাইডগুলিকে প্রতিবার 3 বার, 3 মিনিটের জন্য PBST-এ ডুবিয়ে রাখুন, শোষক কাগজ দিয়ে স্লাইডের অতিরিক্ত তরল শোষণ করুন, পাতলা ফ্লুরোসেন্ট সেকেন্ডারি অ্যান্টিবডি যোগ করুন, 1 ঘণ্টার জন্য 20-37 ডিগ্রিতে ইনকিউবেট করুন একটি ভেজা বাক্সে, PBST স্লাইসে 3 বার, 3 মিনিট প্রতিবার ভিজিয়ে রাখুন।

দ্রষ্টব্য: ফ্লুরোসেন্ট সেকেন্ডারি অ্যান্টিবডি সংযোজন থেকে, পরবর্তী সমস্ত পদক্ষেপগুলি যতটা সম্ভব অন্ধকার জায়গায় করা উচিত।

7. সিরাম ব্লকিং: শোষক কাগজ দিয়ে তরল ব্লট করুন, গ্লাস স্লাইডে নরমাল গোট সিরাম ড্রপ করুন (যদি সেকেন্ডারি অ্যান্টিবডি উত্সটি ছাগল হয়), এবং 30 মিনিটের জন্য ঘরের তাপমাত্রায় ব্লক করুন।

8. প্রাথমিক অ্যান্টিবডি যোগ করুন: শোষক কাগজ দিয়ে ব্লকিং দ্রবণটি শোষণ করুন, ধুয়ে ফেলবেন না, তারপরে মিশ্রিত প্রাথমিক অ্যান্টিবডিটি ড্রপওয়াইজ যোগ করুন এবং প্রাথমিক অ্যান্টিবডি যোগ করার পরে অন্ধকারে একটি 4 ডিগ্রি আর্দ্র বাক্সে রাতারাতি সেঁকুন। (দ্রষ্টব্য: দ্বিতীয় প্রাথমিক অ্যান্টিবডির প্রজাতি প্রথম প্রাথমিক অ্যান্টিবডির প্রজাতি থেকে আলাদা, যেমন মাউস এবং খরগোশ)

9. ফ্লুরোসেন্ট সেকেন্ডারি অ্যান্টিবডি যোগ করুন: স্লাইডগুলিকে প্রতিবার 3 বার, 3 মিনিটের জন্য PBST-এ ডুবিয়ে রাখুন, শোষক কাগজ দিয়ে স্লাইডের অতিরিক্ত তরল শোষণ করুন, পাতলা ফ্লুরোসেন্ট সেকেন্ডারি অ্যান্টিবডি যুক্ত করুন, 1 ঘণ্টার জন্য 20-37 ডিগ্রিতে ইনকিউবেট করুন একটি ভেজা বাক্সে, পিবিএসটি স্লাইসে 3 বার, প্রতিবার 3 মিনিট ভিজিয়ে রাখুন। (দ্রষ্টব্য: প্রথম অ্যান্টিবডি সনাক্তকরণের জন্য যদি লাল ফ্লুরোসেন্স নির্বাচন করা হয়, তবে দ্বিতীয়টি অবশ্যই ফ্লুরোসেন্সের অন্যান্য রঙ নির্বাচন করবে)

10. কাউন্টারস্টেইনিং নিউক্লিয়াস: ডিএপিআই ড্রপওয়াইজে যোগ করা হয়েছিল এবং 5 মিনিটের জন্য অন্ধকারে ইনকিউব করা হয়েছিল, নমুনাগুলি দাগযুক্ত ছিল এবং অতিরিক্ত DAPI PBST 5min×4 বার দিয়ে ধুয়ে ফেলা হয়েছিল।

11. শোষক কাগজ দিয়ে স্লাইডের তরলটি শুকিয়ে নিন, অ্যান্টি-ফ্লুরোসেন্স কোনচার সহ একটি মাউন্টিং তরল দিয়ে স্লাইডটি সীলমোহর করুন এবং ফ্লুরোসেন্স মাইক্রোস্কোপের নীচে ছবিগুলি পর্যবেক্ষণ করুন এবং সংগ্রহ করুন৷