1. কোষ পুনরুদ্ধার
তরল নাইট্রোজেন থেকে ক্রায়োপ্রিজারভড কোষগুলি সরানোর পরে, 37 ডিগ্রি জলের স্নানে অবিরাম ঝাঁকুনি দিয়ে গলিয়ে ফেলা হয়েছিল। গলিত কোষগুলিকে একটি সেন্ট্রিফিউজ টিউবে স্থানান্তর করুন, 37 ডিগ্রিতে পূর্ব-উষ্ণ DMEM সম্পূর্ণ মাধ্যম যোগ করুন (যার মধ্যে ভ্রূণের বোভাইন সিরাম প্রায় 10 শতাংশ), আলতো করে সমানভাবে ফুঁ দিন, 2 মিনিটের জন্য 500 গ্রাম সেন্ট্রিফিউজ করুন এবং সুপারনাট্যান্ট বাদ দিন।
সুপারন্যাট্যান্টকে ধুয়ে ফেলতে DMEM সম্পূর্ণ মাধ্যম যোগ করুন। DMEM সম্পূর্ণ মাধ্যম যোগ করুন, পাইপেটিং করে আলতোভাবে মেশান, একটি সেল সাসপেনশন তৈরি করুন, এটিকে পেট্রি ডিশ/ফ্লাস্কে টিকা দিন এবং 5 শতাংশ CO2 ধারণকারী সেল ইনকিউবেটরে সংস্কৃতি দিন।
2. কোষ উত্তরণ
যখন কোষের ঘনত্ব 80 শতাংশ ~ 90 শতাংশে পৌঁছায় (অকাল ফলন অপর্যাপ্ত, খুব দেরিতে কোষগুলি খারাপ অবস্থায় থাকে, 1:2 থেকে 1:10 বা তার বেশি অনুপাতে উপসংস্কৃতি, সাধারণত 1:3 থেকে 1:5 কোষ তৈরি করা হয়, অর্থাৎ, কোষের ইনোকুলেশন থেকে পৃথকীকরণ এবং পুনঃচাষের সময়, সম্পূর্ণ মাধ্যমটি সরানো হয়েছিল এবং 1X পিবিএস দিয়ে দুবার ধুয়ে ফেলা হয়েছিল।
ট্রিপসিন যোগ করুন (দ্রষ্টব্য: কোষগুলিকে ঢেকে রাখার জন্য হজম দ্রবণের পরিমাণ সর্বোত্তম, এবং সর্বোত্তম হজম তাপমাত্রা 37 ডিগ্রি। একটি মাইক্রোস্কোপের নীচে কোষগুলি পর্যবেক্ষণ করুন: একটি উল্টানো মাইক্রোস্কোপের নীচে হজম হওয়া কোষগুলি পর্যবেক্ষণ করুন, যদি সাইটোপ্লাজম প্রত্যাহার করা হয় তবে কোষগুলি এখন আর একসাথে সংযুক্ত নেই। স্লাইস, যা নির্দেশ করে যে কোষগুলি এই সময়ে সঠিকভাবে হজম হয়েছে), সেগুলি হজম করুন এবং প্রায় 2-3 মিনিটের জন্য সেল ইনকিউবেটরে রাখুন।
ট্রিপসিনাইজেশন বন্ধ করার জন্য উপযুক্ত পরিমাণে DMEM সম্পূর্ণ মাধ্যম যোগ করুন, একটি সেন্ট্রিফিউজ টিউবে স্থানান্তর করুন এবং 2 মিনিটের জন্য 500 গ্রাম সেন্ট্রিফিউজ করুন, সুপারনাট্যান্ট বাদ দিন, ধোয়ার জন্য DMEM সম্পূর্ণ মাধ্যম যোগ করুন এবং সুপারনাট্যান্ট বাদ দিন।
DMEM সম্পূর্ণ মাধ্যম যোগ করুন, আলতো করে পাইপেটিং করে মিশ্রিত করুন, গণনার জন্য 10 মাইক্রোলিটার পিপেট করুন এবং তারপর প্রয়োজনীয় কোষের পরিমাণ অনুযায়ী 5 শতাংশ CO2 ধারণকারী সেল ইনকিউবেটরে সংস্কৃতি চালিয়ে যান।
3. কোষ cryopreservation
যখন কোষের ঘনত্ব 80 শতাংশ ~90 শতাংশে পৌঁছায়, সম্পূর্ণ মাধ্যমটি সরিয়ে ফেলুন এবং 1X PBS দিয়ে 2 বার ধুয়ে ফেলুন। হজমের জন্য ট্রিপসিন যোগ করুন এবং সেল ইনকিউবেটরে প্রায় 2-3 মিনিট রাখুন। ট্রিপসিন হজম বন্ধ করতে DMEM সম্পূর্ণ মাধ্যম যোগ করুন, একটি সেন্ট্রিফিউজ টিউবে স্থানান্তর করুন এবং 2 মিনিটের জন্য 500 গ্রাম সেন্ট্রিফিউজ করুন, সুপারনাট্যান্ট বাদ দিন, ধোয়ার জন্য DMEM সম্পূর্ণ মাধ্যম যোগ করুন এবং সুপারন্যাট্যান্ট বাদ দিন। 1 মিলি হিমায়িত দ্রবণ যোগ করুন (90 শতাংশ ভ্রূণের বোভাইন সিরাম, 10 শতাংশ DMSO। সাধারণভাবে বলতে গেলে, সিরামের উপাদান 10 শতাংশ থেকে 90 শতাংশের মধ্যে সামঞ্জস্য করা যেতে পারে। হিমায়িত দ্রবণে সিরাম যোগ করা একদিকে কোষের জন্য পুষ্টি সরবরাহ করতে পারে, এবং কোষের ক্রিওপ্রিজারভেশনের সময় অ-ভেদ্য প্রতিরক্ষামূলক পদার্থ সরবরাহ করুন, যেমন সুক্রোজ, অ্যালবুমিন ইত্যাদি কোষকে আরও ভালোভাবে রক্ষা করতে), এটিকে একটি ক্রায়োপ্রিজারভেশন টিউবে রাখুন (তাপমাত্রা হ্রাসের গতি নিশ্চিত করার জন্য টিউবে আইসোপ্রোপাইল অ্যালকোহল রয়েছে), অবিলম্বে রাখুন। 30 মিনিটের জন্য একটি 4 ডিগ্রী রেফ্রিজারেটরে ফ্রিজ করুন, তারপর এটিকে 30 মিনিটের জন্য একটি -20 ডিগ্রী রেফ্রিজারেটরে রাখুন, এবং তারপর এটিকে রাতারাতি -80 ডিগ্রী রেফ্রিজারেটরে রাখুন।
পরের দিন এটি তরল নাইট্রোজেনে রাখুন, এটি কমপক্ষে দুই বছরের জন্য সংরক্ষণ করা যেতে পারে এবং আপনি যদি এটি তরল নাইট্রোজেনে না রাখেন তবে এটি তিন মাসের জন্য সংরক্ষণ করা যেতে পারে।
কোষ ক্রায়োপ্রিজারভেশন এবং পুনরুদ্ধারের নীতি হল: ধীরে ধীরে হিমায়িত এবং গলানো, যা কোষের কার্যক্ষমতা বজায় রাখার জন্য আরও সহায়ক। কোনো প্রতিরক্ষামূলক এজেন্ট ছাড়া কোষের ক্রিওপ্রিজারভেশন অন্তঃকোষীয় বরফ স্ফটিক উৎপাদনের দিকে পরিচালিত করবে, যা কোষের অন্তঃসত্ত্বা যান্ত্রিক ক্ষতি ঘটাবে, অন্তঃকোষীয় পরিবেশের অসমোটিক চাপ, পিএইচ, ইলেক্ট্রোলাইট ইত্যাদিতে পরিবর্তন ঘটাবে এবং তারপর কোষের মৃত্যুকে উন্নীত করবে।
4. মনোযোগ প্রয়োজন বিষয়
(1) কালচার সলিউশন প্রিহিটিং: প্রিহিট করার জন্য কালচার সলিউশন, পিবিএস এবং ট্রিপসিন ধারণকারী প্রস্তুত বোতলটি 37 ডিগ্রি ওয়াটার বাথের মধ্যে রাখুন;
(2) অতি-পরিষ্কার ওয়ার্কবেঞ্চ এবং অতিবেগুনী রশ্মি দ্বারা বিকিরণ করা হাত মুছতে 75 শতাংশ অ্যালকোহল ব্যবহার করুন;
(3) ব্যবহৃত যন্ত্রগুলির সঠিক স্থাপন: পর্যাপ্ত পরিচালন স্থান নিশ্চিত করুন, যা শুধুমাত্র পরিচালনা করা সহজ নয় কিন্তু দূষণও হ্রাস করে;
(4) অ্যালকোহল বাতি জ্বালান: লক্ষ্য করুন যে শিখা খুব ছোট হওয়া উচিত নয়;
(5) কঠোর অ্যাসেপটিক অপারেশন;
(6) অনুগত কোষের পরিমিত হজম: হজমের সময় অনেক কারণের দ্বারা প্রভাবিত হয় যেমন হজম দ্রবণের ধরন, প্রস্তুতির সময় এবং কালচার ফ্লাস্কে যোগ করা পরিমাণ। হজম প্রক্রিয়া চলাকালীন, সভ্য কোষের আকারের পরিবর্তনের দিকে মনোযোগ দেওয়া উচিত। একবার সাইটোপ্লাজম সঙ্কুচিত হয়ে গেলে, যদি সংযোগটি আলগা হয়ে যায়, বা টুকরো টুকরো ভেসে যাওয়ার লক্ষণ থাকে, তবে হজম অবিলম্বে বন্ধ করা উচিত;
(7) প্যাসেজড সেলের সমস্ত অপারেশন যতটা সম্ভব অ্যালকোহল ল্যাম্পের শিখার কাছাকাছি হওয়া উচিত। প্রতিটি কক্ষের জন্য এক সেট সরঞ্জাম ব্যবহার করে একবারে শুধুমাত্র একটি ঘরের সাথে কাজ করা ভাল। ক্রস সংক্রমণ এড়াতে;
(8) প্যাসেজড সেলের বোতলের মুখ প্রতিবার খোলা বা বন্ধ করার সময় অ্যালকোহল বাতিতে জীবাণুমুক্ত করা প্রয়োজন।
